Die Ausgangslage der Spielereihe ist das 21. Jahrhundert, in der die Menschheit eine Vielzahl von Kolonien im Weltall besitzt, diese werden durch Horden außerirdischer Monster attackiert. Die Fremden, die vom Bösewicht Mental befehligt werden, erobern Kolonie um Kolonie bis schließlich das gesamte Imperium der Menschheit auf die Erde selbst geschrumpft ist. Um das Überleben der Menschheit zu sichern, wird der Kriegsheld Sam "Serious" Stone, eine lebende Legende, durch ein in Ägypten gefundenes antikes Portal zurück in die Vergangenheit geschickt und landet im Ägypten über 1000 Jahre vor Christus und findet heraus, dass die damals auf der Erde gelandeten Sirianer von den Ägyptern als Götter verehrt wurden. Offenbar befindet sich zu diesem Zeitpunkt das sirianische Raumschiff noch irgendwo im Sonnensystem. Auf der Suche danach stellen sich Sam Stone jedoch zahllose Horden außerirdischer Kreaturen in den Weg.
In The Second Encounter hingegen stürzt Sam mit dem schließlich gefundenen Raumschiff auf der Erde in Südamerika ab und muss sich sowohl durch den Dschungel als auch durch Babylon und mittelalterliche Städte kämpfen. In einer gotischen Kathedrale findet er schließlich ein weiteres Raumschiff, mit dem er erneut in Richtung Sirius aufbricht, um Mental zu stellen.
Die Grundhandlung von Serious Sam baut auf der Idee der Prä-Astronautik auf. So erfährt man in The First Encounter, dass das außerirdische Volk der Sirianer damals im Alten Ägypten landete und die dortige Kultur beeinflusste. Im letzten Level des Spieles gelangt man über die Cheops-Pyramide dann auch auf ein sirianisches Raumschiff, womit ähnlich wie bereits in dem Film Stargate die Pyramiden wohl einen Weltraumbahnhof für außerirdische Raumschiffe darstellten. Die weiteren Teile vertiefen das Thema jedoch nicht, sondern nehmen es lediglich als anfänglichen Aufhänger, um eine (mehr oder weniger scherzhafte) Erklärung für die Gestaltung der Spielwelt bereitzustellen.